Pemicu Fusi Membran oleh Spike Protein (S-Protein) Coronavirus

     Pemicu spike protein coronavirus untuk mengalami transisi konformasi menunjukkan pola yang lebih kompleks dibandingkan dengan protein fusi membran kelas I lainnya, mungkin disebabkan karena fitur yang unik pada strukturnya. Spike protein coronavirus seringkali mengalami proteolisis saat proses masuknya virus ke dalam sel, dan kadang hal ini terjadi setelah terjadinya ikatan dengan reseptor. Dengan demikian, proteolisis dapat mengarahkan langsung ke fusi membran sehingga berfungsi sebagai pemicu penting untuk fusi membran (Belouzard et al., 2012). Protease inang yang memutus spike protein coronavirus utamaanya berasal dari empat fase siklus infeksi virus: (a) proprotein convertase (misalnya furin) selama pengemasan virus di dalam sel yang memproduksi virus, (b) protease ekstraseluler (misalnya elastase) setelah virus diepaskan ke ruang ekstraseluler, (c) protease permukaan sel (misalnya type II transmembrane serine protease – TMPRSS2) setelah virus berikatan dengan sel target, dan (d) protease lisosom (misalnya cathepsin L dan cathepsin B) setelah virus mengalami endositosis pada sel target (Millet & Whittaker, 2015). Sebagai tambahan selain proteolisis, pemicu tradisional seperti pengikatan reseptor dan pH yang rendah mungin berperan dalam fusi membran.

Gambar 1. Fusi membran pada coronavirus dipicu oleh pemotongan protein spike,
gunting mengindikasikan aktivitas protease pada berbagai fase virus

     Sebagai prototip dari coronavirus, telah  dilaukan pengujian pada MHV secara ekstensif mengenai mekanisme masuknya ke dalam sel. Hasil temuan tersebut kompleks dan kadang kontradiktif antara yang satu dengan lainnya. Pertama, spike MHV mengalami pemotongan proprotein convertase pada saat pengemasan virus di dalam sel yang memproduksi virus (Spaan et al., 1988). Proteolisis ini sangat penting bagi masuknya MHV ke dalam sel target. Kedua, ikatan dengan CAECAM1 memicu transisi konformasi dari spike MHV dan diikuti oleh fusi membran. Hal ini didukung dengan observasi bahwa inkubasi spike MHV dengan CAECAM1 rekombinan terlarut meningkatkan hidrofobisitas dari S2 MHV dan penampakan fragmen S2 yang resisten protease (Matsuyama & Taguchi, 2002). Hal ini menunjukkan adanya paparan fusion peptide dan pembentukan bundel enam-helix pada fase postfusi S2. Ketiga, terdapat beberapa laporan yang kontradiktif apakah MHV memasuki sel target pada membran sel atau melalui endositosis dan apakah spike MHV mengalami transisi konformasi pada pH rendah, netral, atau tinggi (Zelus et al., 2003). Hal ini dapat dipengaruhi oleh strain MHV yang diperiksa atau pendekatan eksperimental yang digunakan dalam studi. Peran pH dan endositosis pada masuknya MHV ke dalam sel masih perlu diklarifikasi lebih lanjut. Menariknya, strain neurotropik MHV-JHM dapat memediasi masuknya virus ke dalam sel inang yang tidak mengekspresikan CAECAM1 (Nakagaki et al., 2005). Masuknya MVH-JHM yang tidak bergantung pada reseptor merupakan hal yang unik di antara berbagai jenis virus. Karakteristik bikomia spike MHV-JHM menunjukkan bahwa spike tersebut lebih labil dibandingkan dengan dari strain MHV yang lain, hal ini berarti bahwa spike dapat mengalami transisi konformasi secara spontan tanpa adanya reseptor (Ontiveros et al., 2003). Strain MHV-JHM dipercaya dapat menginfeksi sel syaraf yang mengekspresikan CAECAM1 dalam jumlah yang rendah. Dengan demikian, mekansime fusi membran dari spike MHV bergantung baik pada proteolisis dan ikatan dengan reseptor, dan mungkin dapat bergantung atau tidak bergantung pada pH endosom yang rendah, serta fusi membran yang independen dari reseptor oleh spike HMV-JHM berkonribusi pada tropisme netral dari strain MHV-JHM.

     Penelitian yang dilakukan pada mekanisme masuknya SARS-CoV ke dalam sel telah memberikan penemuan baru. Pertama, protein spike SARS-CoV tidak dipotong oleh proprotein convertase selama pengemasan virus sehingga masih intak pada virion yang sudah mengalami maturasi (Song et al., 2004). Namun, SARS-CoV masuk ke dalam sel inang melalui endositosis, dan protein spikenya diproses oleh protease lisosom (misalnya cathepsin L dan cathepsin B) (Simmons et al., 2005). Hal ini didukung dengan pengamatan bahwa penghambatan asidifikasi endosomal atau sistein protease lisosom mencegah masukya SARS-CoV ke dalam sel. Namun, pH yang rendah bukan merupakan pemicu masuknya virus ke dalam sel. Hal ini didukung dengan pengamatan bahwa ketika fusion peptide diekspresikan pada permukaan sel dan dipotong oleh protease eksogen, protein spike SARS-CoV dapat memediasi fusi membran virus pada sel yang mengekspresikan ACE2 pada kondisi pH netral (Simmons et al., 2004). Sehingga, peran pH yang rendah pada masuknya SARS-CoV ke dalam sel adalah dengan mengaktifkan protease lisosom, yang kemudian akan mengaktifkan spike SARS-CoV untuk fusi membran. Hal ini berbeda dengan HA pada virus influenza, yang diaktivasi melalui ikatan proton pada lingkungan pH rendah di dalam endosome. Kedua, baik protease ekstraseluler (misalnya elastase pada saluran pernapasan) dan protease permukaan sel (misalnya TMPRSS2 pada permukaan sel pneumosit) juga mengaktivasi protein spike SARS-CoV untuk fusi membran (Glowacka, 2011). Oleh karena tropisme sel dan jaringan, protease tersebut sepertinya berkontribusi terhadap tropisme SARS-CoV pada saluran pernapasan dan sel pneumosit. Ketiga, sebagai tambahan dari lokasi pemotongan pada batas S1/S2, lokasi kedua, S2’ telah diidentifikasi pada ujung amin- (N terminus) dari fusion peptide pada S2 (Beluozard et al., 2009). Pemotongan pada batas S1/S2 menghilangkan batas struktural dari S1, sedangkan pemotongan pada S2’ melepaskan fusion peptide internal untuk bergabung dengan membran target. Keempat, masih belum jelas apakah ikatan dengan reseptor ACE2 merupakan pemicu dari protein spike SARS-CoV untuk fusi membran. Dua studi menggunakan miskroskop elektron bahwa tidak atau sedikit terjadi perubahan konformasi dari protein spike SARS-CoV berkaitan ikatan dengan reseptor ACE2 (Beniac et al., 2007). Namun, studi lain menunjukkan adanya perubahan konformasi pada protein spike SARS-CoV, yang sebelumya terekspos protease kriptik pada lokasi pemotongan (Simmons et al., 2013). Peran ikatan ACE2 pada fusi membran masih perlu dilakuakn penelitian lebih lanjut. Namun, masuknya SARS-CoV tidak bergantung pada rendahnya pH, akan tetapi sedikitnya membutuhkan dua pemotongan protease pada protein spike oleh protease lisosom, protease ekstraseluler, atau protease permukaan sel.

     Secara keseluruhan, mekanisme masuknya MERS-CoV sama dengan masuknya SARS-CoV. Seperti halnya protein spike SARS-CoV, protein spike MERS-CoV harus dipotong pada kedua lokasi baik pada batas S1/S2 dan S2’ oleh protease agar terjadi fusi membran (Millet & Whittaker, 2014). MERS-CoV juga masuk ke dalam sel melalui endositosis dan diaktivasi oleh sistein protease lisosom untuk fusi membran. Selainn, itu protease ekstraseluler dan protease permukaan sel juga berperan dalam aktvasi masuknya virus ke dalam sel (Qian et al., 2013). Tidak seperti SARS-CoV, protein spike MERS-CoV dipotong oleh proprotein convertase inang selama pengemasan virus. Uniknya, meskipun mengenali reseptor DPP4 yang sama, MERS-CoV dan HKU4 berbeda dalam aktivitasnya untuk memediasi masuknya virus: HKU4 memediasi masuknya virus ke dalam sel kelelawar tetapi tidak pada sel manusia, sedangkan MERS-CoV memediasi masuknya virus baik ke dalam sel manusia maupun kelelawar (Yang et al., 2015). Terdapat dua perbedaan residu yang telah diidentifikasi antara protein spike MERS-CoV dan HKU4 yang berperan terhadap perbedaan fungsinya, dimana pada MERS-CoV dapat diaktivasi oleh proprotein convertase pada manusia dan sistein protease lisosom. Dengan demikian, dua mutasi berperan penting dalam transmisi MERS-CoV dari reservoir alamiah kelelawar kepada manusia, baik secara langsung maupun melalui intermediasi inang unta. Pada sisi lain, protein spike HKU4 dapat diaktivasi oleh protease lisosom kelelawar tetapi tidak oleh protease lisosom manusia, menunjukkan bahwa protease lisosom kelelawar dan manusia memproses protein spike virus secara berbeda. Studi mengenai masuknya MERS-CoV menunjukkan bahwa perbedaan aktivitas pada protease yang memotong spike coronavirus dari inang yang berbeda dapat menjadi penghalang bagi transmisi antar spesies (Li, 2016).

     Secara ringkas, protease merupakan pemicu esensial pada protein spike coronavirus untuk fusi membran, karena pemotongan pada batas S1/S2 dan lokasi S2’ dapat menghilangkan hambatan struktural dari S1 pada S2 dan melepaskan fusion peptide internal. Diantara protease inang, protease lisosom memberikan sumber yang paling dapat berperan dalam pemrosesan protein spike karena jumlahnya yang banyak dan terdapat pada berbagai macam tipe sel. Ketersediaan beberapa protease lainnya (misalnya proprotein convertase, protease ekstraseluler, dan protease permukaan sel) berganutng dari jenis sel dan jaringan, mengatur tropisme jaringan dari coronavirus. Lebih lanjut, aktivitas protease dari inang yang berbeda dapat berlainan, mengatur jangkauan inang dari coronavirus. Beberapa faktor pemicu masuknya coronavirus (misalnya ikatan reseptor dan pH yang rendah) mungkin bergantung pada spesifisitas atau strain yang berbeda dari coronavirus. Secara keseluruhan, tujuan dari pemicu fusi membran ini adalah melawan pembatas energi untuk melakukan transisi konformasi pada protein spike.

Edit: 05 April 2020

Referensi:

• Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. 2009. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proc Natl Acad Sci USA. 106(14):5871-6.
• Belouzard, S., Millet, J. K., Licitra, B. N., Whittaker, G. R. 2012. Mechanisms of coronavirus cell entry mediated by the viral spike protein. Viruses. 4(6):1011-33.
• Beniac, D. R., deVarennes, S. L., Andonov, A., He, R., Booth, T. F. 2007. Conformational reorganization of the SARS coronavirus spike following receptor binding: implications for membrane fusion. PLoS One. 2(10):e1082.
• Glowacka, I., Bertram, S., Müller, M. A., Allen, P., Soilleux, E., Pfefferle, S., Steffen, I., Tsegaye, T. S., He, Y., Gnirss, K., Niemeyer, D., Schneider, H., Drosten, C., Pöhlmann, S. 2011. Evidence that TMPRSS2 activates the severe acute respiratory syndrome coronavirus spike protein for membrane fusion and reduces viral control by the humoral immune response. J Virol. 85(9):4122-34.
• Li, F. 2016. Structure, function, and evolution of coronavirus spike proteins. Annu Rev Virol. 3(1):237–261.
• Matsuyama, S., Taguchi, F. 2002. Receptor-induced conformational changes of murine coronavirus spike protein. J Virol. 76(23):11819-26.
• Millet, J. K., Whittaker, G. R. 2014. Host cell entry of Middle East respiratory syndrome coronavirus after two-step, furin-mediated activation of the spike protein. Proc Natl Acad Sci USA. 111(42):15214-9.
• Millet, J. K., Whittaker, G. R. 2015. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Res. 202():120-34.
• Nakagaki, K., Nakagaki, K., Taguchi, F. 2005. Receptor-independent spread of a highly neurotropic murine coronavirus JHMV strain from initially infected microglial cells in mixed neural cultures. J Virol. 79(10):6102-10.
• Ontiveros, E., Kim, T. S., Gallagher, T. M., Perlman, S. 2003. Enhanced virulence mediated by the murine coronavirus, mouse hepatitis virus strain JHM, is associated with a glycine at residue 310 of the spike glycoprotein. J Virol. 77(19):10260-9.
• Simmons, G., Gosalia, D. N., Rennekamp, A. J., Reeves, J. D., Diamond, S. L., Bates, P. 2005. Inhibitors of cathepsin L prevent severe acute respiratory syndrome coronavirus entry. Proc Natl Acad Sci USA. 102(33):11876-81.
• Simmons, G., Reeves, J. D., Rennekamp, A. J., Amberg, S. M., Piefer, A. J., Bates, P. 2004. Characterization of severe acute respiratory syndrome-associated coronavirus (SARS-CoV) spike glycoprotein-mediated viral entry. Proc Natl Acad Sci U S A. 101(12):4240-5.
• Simmons, G., Zmora, P., Gierer, S., Heurich, A., Pöhlmann, S. 2013. Proteolytic activation of the SARS-coronavirus spike protein: cutting enzymes at the cutting edge of antiviral research. Antiviral Res. 100(3):605-14.
• Song, H. C., Seo, M. Y., Stadler, K., Yoo, B. J., Choo, Q. L., Coates, S. R., Uematsu, Y., Harada, T., Greer, C. E., Polo, J. M., Pileri, P., Eickmann, M., Rappuoli, R., Abrignani, S., Houghton, M., Han, J. H. 2004. Synthesis and characterization of a native, oligomeric form of recombinant severe acute respiratory syndrome coronavirus spike glycoprotein. J Virol. 78(19):10328-35.
• Spaan, W., Cavanagh, D., Horzinek, M. C. 1988. Coronaviruses: structure and genome expression. J Gen Virol. 69 (12):2939-52.
• Qian, Z., Dominguez, S. R., Holmes, K. V. 2013. Role of the spike glycoprotein of human Middle East respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV) in virus entry and syncytia formation. PLoS One. 8(10):e76469.
• Yang, Y., Liu, C., Du, L., Jiang, S., Shi, Z., Baric, R. S., Li, F. 2015. Two Mutations Were Critical for Bat-to-Human Transmission of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus. J Virol. 89(17):9119-23.
• Zelus, B. D., Schickli, J. H., Blau, D. M., Weiss, S. R., Holmes, K. V. 2003. Conformational changes in the spike glycoprotein of murine coronavirus are induced at 37 degrees C either by soluble murine CEACAM1 receptors or by pH 8. J Virol. 77(2):830-40.